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WB系列 | 转膜

发布日期:2020-09-24浏览量:1207次

转膜

转膜,即将蛋白凝胶中的蛋白,通过电流作用转移至转印膜上。由于蛋白凝胶本身易碎,蛋白条带易容易在凝胶中扩散,而且抗体也不易进入凝胶中与目的蛋白结合。所以需要在转印膜这样的固相载体上实现后续封闭,洗涤,显色等实验操作。




01

膜的选择






杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。

常用的杂交膜有两类:硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。两者特点对比如下:




02

转膜方式






主要有两种:槽式湿转和半干转移。

前者操作容易,转移效率高;后者适用于大胶的蛋白转移,所用缓冲液少。




03

实战操作






1. 将剪好的PVDF膜用无水甲醇润湿30秒以上。

2. 装配转膜三明治结构(如下示意图):黑面(负极)→海绵→3层滤纸→胶→转印膜→3层滤纸→海绵→红面(正极),每层之间不能有气泡。然后,将三明治转移至电泳槽中(黑面对黑面),注意电极一定要正确。

3. 加入转膜液

推荐使用新赛美 快速转膜液  货号:WB4600设定恒流400 mA,时间25-30min完成蛋白转膜。

产品特色:

1.高效安全:不使用甲醇,减少有毒试剂使用

2.快速稳定:能在25-30分钟完成转膜过程,产热量小,减少蛋白损失

3.兼容性好:兼容Laemmli胶,预制胶,FastPAGE,Bis-Tris胶等多种凝胶


建议事项

(1)转印电流建议设定恒流400mA, 一般25-30分钟可以将150kD以下蛋白完全转印;小于100kD蛋白20分钟即可完全转印;对于大于150kD蛋白,建议延长5-10分钟。

(2)凝胶的浓度影响转印的效率,对于胶浓度7.5%,20分钟即可完成转印;对于胶浓度10%,25-30分钟即可完成转印;对于胶浓度大于10%,建议延长5-10分钟.

(3)短时间转膜时不需要放冰上,否则会影响效率。

(4)转膜时,要根据不同分子量蛋白选择相适应的凝胶浓度,原则是:高分子量蛋白选低浓度胶,低分子蛋白选择高浓度胶。

(5)检测多个蛋白时,建议切胶分别转膜。




04

转膜效果确认常用方法






转膜后,如果想确认下转膜效果,再继续试验,可参考如下方法:

1. 丽春红S印迹膜染色法

带负电荷的丽春红S与带正电的氨基酸残基及蛋白的非极性区结合,从而形成红色条带。丽春红S与蛋白质的结合是可逆性的,红色染料很容易洗掉,不影响后续WB检测。


2. 考马斯亮蓝凝胶染色法

对转膜后的蛋白凝胶进行染色,以检测残留蛋白。推荐使用快速蛋白染色液货号:P61000,灵敏度高,仅1小时或更短时间即可完成染色,脱色直接用去离子水即可。

 

3. 预染蛋白Mark判断

实时监测,分子量做参照。


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